什么是基线分离？分离度如何定？

无论是何种分离色谱，对于目标成分的分离均有相应要求。以中国药典通则色谱法项下的相关描述为例，薄层色谱中要求“除另有规定外，分离度应大于1.0”，高效液相色谱法、离子色谱法及气相色谱法等要求“除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应不小于1.5”，分子排阻色谱法中要求“除另有规定外，分离度应大于2.0”。

从上述要求中可以直观的看出，不同色谱技术对于分离度的要求不尽相同，至于个中缘由我们暂不揣度。只是有一点很重要：分离度不是指导原则等文件规定死的一个参数，正如大多技术参数一样，始终是为了满足使用目的而进行的“私人订制”，量后裁！

一、什么是基线分离？

图1  基线分离示例

但是，理论指导实践，实践是检验真理的唯一标准。比如说，上面对于基线分离的描述情形，在实际工作中基本不可能，而且说“基本”是为了满足“一切皆有可能”的严谨，否则可以直接说“根本不可能”。因为德国哲学家莱布尼茨说，世界上没有完全相同的两片树叶，而每一个色谱工作者都可以说，世上没有完全相同的两个色谱峰。

图2 分离度及谱峰相对大小（面积）与分离度关系《实用高效液相色谱法的建立》

既然如此，那我们就不要再执念于分离度1.5了，也不要自欺欺人的出具一个显示分离度大于1.5的色谱报告而不看实际分离效果了。

二、分离度如何定？

仿制药或者改良型新药，甚至创新药！99.9%的核心技术思想离不开模仿、借鉴，还有0.1%留给那些从0到1的“传说”。同样的，我们这个问题，不妨看看别人家的孩子是如何优秀解决的。

下表1列举了从中国药典以及欧洲药典中随机摘录了一些典型的实例，对于分离要求可以说是“五花八门”。当然，这里对于具体品种为何制定了当前的分离要求，以及做了哪些研究，我们暂不做深究，也确实有心无力，无从下手，仅仅从表象来看个热闹。

如果说中国药典中的例子还算中规中矩的拓宽了我们对分离度1.5的认识，那欧洲药典分离度3.3、1.7、1.1是什么操作？这种有零儿有整儿的分离度是怎么搞出来的儿？峰谷比又是什么操作，跟分离度有什么区别，我该怎么选？看完以后什么感觉？眼花缭乱，再加上点眩晕，有点上头！

带着一脑门儿的问号，总感觉，法典里透着点草率，严谨中不失那么点随意。要不是看在欧洲药典的面子上，领导不得骂的你找不着北？

能！大写的。

而且，在这个彰显个性，鼓励创新的时代里，建议不要做分离度1.1、3.3这种纯仿制，也不要假模假式的做一些分离度1.2、3.4这种me-too，可以尝试做一些分离度2.2、4.4这种me-better，或者大胆一点做一些分离度1.03、2.21这种四不像。

三、如何证明合理性？

实际工作中也接触到不少人有这个想法：当分离度连中国药典那除另有规定外的1.5都达不到时，开始动了定分离度1.0、1.2的心思。但往往只是大笔一挥而已！比如，方法开发及方法验证时实际分离度为1.4，为了日后方法系统适用性通过性的保险起见，怀着一丝的忐忑，带着欧洲药典的一丝安慰，标准制定时写下了1.2，大胆一点的直接来个1.0。

当然，不仅是达不到分离度1.5时的退让，更有很多达到1.5后的前进，比如分离度应大于10.0。这些数值的制定不仅仅是一个耐用性的探索，更不是冒险或保守之类的估计，而是需要具体的试验设计去验证。

图3  “甲磺酸溴隐亭”有关物质分析方法系统适用性图谱

根据以上信息，我们可以推断的是，实际分离效果肯定不止1.1，这只是一个最低可接受限度。因此在正常色谱条件下对方法进行完整验证后，针对希望拟定的分离度再次进行试验设计以验证合理性。

1、拟定分析方法耐用性的关键参数：碳酸铵溶液浓度、流速、柱温、色谱柱及仪器。

2、拟定关键耐用性参数在日常检测中可能出现的偏离，比如碳酸铵溶液浓度由于配制过程导致的误差，由于仪器本身性能导致的流速及柱温控制差异，色谱柱批次间的差异，不同仪器（型号、品牌）之间的差异。这些差异均可以根据经验及相关的性能确认（PQ）进行预先估计，在估计的基础上适当放宽考察。

3、在上述各种拟定的偏离条件下进行分离度考察，确定最差分离度，比如说是在流速2.2ml/min时分离度为最差的1.1。

4、在流速2.2ml/min，分离度为1.1的条件下，设计杂质A与杂质B的灵敏度（检测限、定量限），线性与范围，准确度（加标回收）试验。此时，我们甚至可以在该条件下兼顾其他杂质的再次验证。

5、在最差分离度条件下，各项验证均满足拟定的验证要求时（不一定非得完全按照中国药典9101的要求），可以合理的制定所希望的分离度或峰谷比。

此外，尚需说明一点的是，耐用性不是通过性验证，无需拟定范围后追求耐用性试验的通过。耐用性的参数应在方法开发阶段已完成边界的探索，并进行了初步的验证；在方法学验证阶段根据开发时的边界，适当调整符合实际使用场景的参数偏离范围并进一步的确认。